Мониторинг бактериопланктона
Отбор проб
Обязательным условием микробиологических работ на водоемах является неукоснительное соблюдение правил стерильного отбора проб. Стерильность отбора необходима при всех работах, связанных с посевами микроорганизмов на питательные среды. С поверхности вода берется стерильной бутылкой, Предварительно она тщательно моется хромовой смесью, чтобы на стенках не было органических веществ и бактериальных клеток. В горлышко бутылки вставляется ватная пробка с марлевой салфеткой. Сверху накладывают салфетку из жесткой бумаги и завязывают ниткой.Вода из поверхностного горизонта реки и озера может быть отобрана с лодки. Для этого бутылку берут в ладонь у горлышка, другой рукой с нее снимают салфетку и вытаскивают пробку. На расстоянии руки от лодки бутылку погружают в воду на глубину 5-10 см. Отбор производят при медленном перемещении лодки у ее носа, чтобы в бутылку не попадала вода, которая соприкасалась с бортами лодки. После наполнения часть воды выливают и сосуд затыкают той же стерильной пробкой.
Для отбора проб воды с глубины от 0 до 30 м используют бутылочный батометр. Перед отбором пробы в поддон ставят стерильную бутылку, на плечи которой надвигают и закрепляют винтами хомутик. Из бутылки вынимают ватную пробку и на ее место вставляют резиновую настолько прочно, чтобы батометр висел на маленькой веревке и пробка не выскакивала. Предварительно резиновую пробку тщательно обтирают спиртом и обжигают. В таком виде батометр опускают на нужную глубину, резким рывком основной веревки пробку выдергивают из бутылки и через полминуты батометр поднимают на поверхность. Бутылку снимают, верхний слой воды сливают из горлышка и той же ватной пробкой закрывают.
Посевы необходимо проводить не позже чем через 1 час после взятия образцов воды или же через несколько часов, если хранение проб осуществлялось при температуре 3-5oС При посевах соблюдают необходимые предосторожности во избежание заражения посевного материала: стол и руки протирают спиртом; горлышки стерильных колб, бутылок и пробирок открывают над пламенем горелки и обжигают их; стерильные пипетки вынимают из упаковки также над пламенем и обжигают их кончики; крышки стерильных чашек Петри при посевах поднимают как можно ниже и на возможно короткое время вблизи горящей спиртовки. Для каждого разведения используют отдельную пипетку. Все операции при посевах выполняются по возможности быстро.
Стерилизация посуды и сред
Питательные среды, используемые при микробиологических работах, стерилизуют в автоклаве при 120оС в течение 20 мин. В автоклаве стерилизуют также воду для разведения, резиновые предметы (пробки, трубки), металлические инструменты и при необходимости посуду. Среды стерилизуют в небольших сосудах (склянках или колбах объемом не больше 1 л); сосуды заполняются средой не более чем на 1/3. Колбы закрывают ватной пробкой и обвязывают колпачком из плотной бумаги, на котором простым карандашом пишут название среды. Пробирки с приготовленной для разведений водопроводной водой (или физиологическим раствором — 8,5 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) помещают по 10-15 штук в металлические банки с ватной прокладкой на дне и обертывают сверху плотной бумаге. Резиновые пробки заворачивают в плотную бумагу.Поместив приготовленные для стерилизации предметы ни подставку в автоклав, герметически закрывают крышку. Трубку, выводящую нар, оставляют открытой и начинают нагревать котел. Вода через некоторое время закипает, пар вытесняет воздух из котла. Когда весь воздух вытеснится паром, закрывают выходное отверстие.
Как только выход пара прекращен, манометр начинает показывать увеличение давления, которое доводят до 1 атм. Затем уменьшают нагревание прибора настолько, чтобы давление оставалось на одном уровне. Это давление сохраняют 20 мин, затем прекращают нагревание, давление постепенно падает. Когда оно дойдет по манометру до нуля, открывают кран, выводящий пар. Как только пар выпущен, отвинчивают крышку. Предметы вынимают через некоторое время после окончания стерилизации, дождавшись подсушивания бумаги и пробок.
Стерилизацию сухим жаром производят в сушильном шкафу при температуре 150-170оС. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта, высушена и завернута в бумагу. Чашки Петри заворачивают по четыре вместе. Пипетки перед стерилизацией затыкают с широкого конца ватой и заворачивают поодиночке в узкие длинные ленты тонкой папиросной бумаги. Затем партию пипеток по 15-20 штук заворачивают в плотную бумагу и надписывают на бумаге объемы пипеток. Склянки для отбора проб должны быть закрыты ватной пробкой, а сверху колпачком из плотной бумаги, обвязанным шпагатом вокруг горлышка. Пробирки и пенициллиновые склянки закрывают ватными пробками, заворачивают в плотную бумагу и перевязывают шпагатом. Стеклянные и резиновые пробки для склянок и пробирок стерилизуют отдельно, завернутыми в плотную бумагу, причем резиновые пробки необходимо стерилизовать в автоклаве.
Приготовленные для стерилизации предметы помещают в сушильный шкаф и стерилизуют при 150оС в течение 2 часов, при 160оС — 1 час, при 170оС — 20 мин. После прогревания при одной из этих температур в течение указанного времени сушильный шкаф выключают и дожидаются падения температуры до комнатной, после чего дверцы шкафа открывают и вынимают простерилизованные предметы
Микроскопический учет общего количества бактерий в воде
Взятую для анализа пробу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,3-0,7 мкм в фильтровальной установке, состоящей из толстостенной колбы Бунзена, металлической воронки Зейтца и вакуумного насоса, при помощи которого понижают давление примерно до 0,4 атм. Фильтры предварительно кипятят в дистиллированной воде, которую несколько раз меняют. В зависимости от типа водоисточника, степени его загрязнения и диаметра воронки фильтруют различные объемы воды (табл. 4).|
|
|
|
|---|---|---|
|
|
|
|
| Артезианские воды, ключи, родники |
|
|
| Чистые районы рек, озер, водохранилищ |
|
|
| Загрязненные участки |
|
|
На фильтре карандашом делается отметка с указанием номера станции, даты и профильтрованного объема воды. Серию фильтров укладывают в чашку Петри и высушивают на воздухе. На крышку чаши капают 1-2 капли 40%-ного формалина. На чашке делают отметку о водоеме и дате анализа (месяц, год). В таком виде фильтры могут храниться до их окрашивания карболовым эритрозином.
Для окрашивания в чашку Петри помещают кружок фильтровальной бумаги, которую сманивают краской, на нее нижней стороной кладут фильтры и закрывают крышкой. С внутренней стороны крышки чашки также кладется фильтровальная бумага, чтобы на фильтры не капала конденсационная вода.
После окончания окрашивания (в течение 14-16 часов) эритрозин с мембранных фильтров отмывают, перекладывая их пинцетом на листе фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной водой. Фильтры перекладывают до тех пор, пока они не будут давать слабую розовую окраску фильтрованной бумаге. Затем фильтры высушивают на воздухе. После высушивания рабочая площадь фильтра (со взвесью) должна быть розовой, края — слабо розовыми, а бактерии — ярко красными.
Для подсчета микроорганизмов, задержанных на фильтре, на предметное стекло наносится капля иммерсионного масла, на него накладывают кусочек окрашенного мембранного фильтра (примерно 1/8 фильтра) фильтрующей поверхностью к объективу. Сверху на фильтр наносят еще каплю масла и просматривают под иммерсионным объективом с 90-кратным увеличением и окуляром с 10-кратным увеличением. В окуляр помещается сетка площадью примерно 2500 мкм2 (точную площадь необходимо определить с помощью объект-микрометра).
Просчитывать следует 20 полей зрения в разных местах фильтра, чтобы в просчитываемой сетке было не меньше 50 и не больше 150 микроорганизмов. Одновременно следует окрасить (предварительно прокипятив) и просмотреть под микроскопом контрольные фильтры для учета бактериального загрязнения фильтров. Число бактерий на опытных фильтрах должно быть примерно в 10 раз больше, чем на контрольных. Результаты контроля вычитаются из данных опыта.
Расчет содержания бактерий в 1 мл воды (Х) проводится по формуле (буквенные обозначения см. в приложении 10.2):
, Учет эвтрофных (сапрофитных) бактерий
Из каждой пробы воды для посевов должно быть осуществлено не менее двух различных разведений (заранее намеченных): из каждого разведения посевы должны быть произведены не менее чем в две чашки. Разведение подбирают с таким расчетом, чтобы на чашке росло не меньше 20 и не больше 120 колоний бактерий. Из чистых водоемов для посевов можно брать 0,1-1 мл воды. Для посевов из загрязненных участков берется от 0,01 до 0,00001 мл пробы. Например, если в водоеме ожидается несколько тысяч сапрофитных бактерий в 1 мл, необходимо посеять 0,01 мл, для чего использовать I (0,1 мл) или II разведение (1 мл). При количестве сапрофитных бактерий, доходящем до сотен тысяч в 1 мл, следует посеять 0,0001 мл, для чего использовать III (0,1 мл) или IV разведение (1 мл) и т.д.Посев производится на определенную среду.
Рецепты питательных сред
|
|
|
| МПА сухой | 50 г |
| Вода дистиллированная | 1 л |
|
|
|
| Вода водопроводная | 1 л |
| Мясной кубик | 1 шт. |
| Пептон | 10 г |
| NaCl | 2 г |
| K2HPO3 | 1 г |
| Агар-агар | 20 г |
|
|
|
| Мясная вода | 1 л |
| Пептон | 10 г |
| NaCl | 2 г |
| Агар-агар | 20 г |
Техника посева заключается в следующем. Проба воды взбалтывается, исследуемая вода берется стерильной пипеткой в количестве, предназначенном для посева (в случае необходимости посеять меньше 0,1 мл используют посев из разведений по вышеприведенной схеме), и вносится в стерильную чашку Петри с соответствующей надписью. Питательный мясо-пептонный агар (МПА или МПА:10) должен быть заранее расплавлен на водяной бане и охлажден до температуры 40оС (колба с расплавленным агаром не должна обжигать ладонь руки). Этот агар выливается из колбы в чашку прямо на внесенную воду. Немедленно по выливании агар тщательно смешивается с исследуемой водой путем легкого вращательного движения чашки на поверхности стола. Агар должен быть распределен по дну чашки ровным тонким слоем без пузырьков воздуха и без незалитых пространств. Надо следить, чтобы агар не попал на борт чашки. После застывания агара чашки переворачивают вверх дном и заворачивают в бумагу, на которой пишется дата. Подсчет выросших колоний на чашках с МПА производят через 7 дней, а на чашках с разбавленным агаром (МПА:10) — через 15 дней. Инкубацию чашек проводят при 20оС Пересчет на 1 мл делают на основании средних данных, полученных при росте на чашках из одной пробы. Чашки с очень большим или очень малым числом выросших колоний (более 120 или меньше 20 на одной чашке) при пересчете не используют.
Учет олиготрофных бактерий
Воду исследуемого водоема разливают в 8 пробирок по 10 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5-0,75 атм. Затем пробирки на 6-8 часов помещают в герметичный шкаф в атмосферу углекислоты для приведения рН к нейтральному значению. После этого их нумеруют и расставляют в штатив. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 1 мл воды, затем после тщательного перемешивания другой пипеткой 1 мл этой воды переносят во 2-ю пробирку и т. д. При посеве воды из водоемов проводят до 6-7 разведений, 7-я или 8-я пробирка служит контролем. Инкубируют посевы две недели при 20оС. Затем производят посев на МПА:10 из каждой пробирки по 1 мл и через 10 сут инкубации отмечают разведение, в котором отсутствует рост бактерий на этой среде.Учет количества спор бактерий
В стерильную пробирку отливают 15-20 мл исследуемой воды, помещают ее в водяную баню и прогревают в течение 10 мин при температуре 80оС (температуру определяют в одной из пробирок). Затем производят посев на МПА аналогично тому, как это делается при посеве сапрофитных бактерий. Рекомендуемое количество воды для посева — 1 и 0,1 мл. После инкубирования в термостате при 30оС подсчитывают количество выросших колоний (число которых на чашке, как и при определении сапрофитов, не должно превышать 120 и не быть меньше 20) и делают пересчет на 1 мл.Учет специализированных групп бактерий
При наличии резко выраженного нефтяного загрязнения или при исследовании сточных вод, в которых в большом количестве находятся нефтепродукты, целлюлоза, фенолы, серосодержащие соединения, делают посевы на специализированные среды, позволяющие судить о развитии микроорганизмов, разрушающих эти соединения.а) Углеводородокисляющие микроорганизмы
Простерилизованную минеральную среду Диановой-Ворошиловой разливают на 1/3 в стерильные склянки из-под пенициллина (примерно 4-5 мл) и добавляют 4-5 капель нефтепродукта (0,05 мл), простерилизованного в запаянных ампулах. Обычно используют нефть, мазут, соляровое или машинное масло, дизельное топливо.| Вода дистиллированная | 1 л |
| NH4NO3 | 1 г |
| K2HPO4 | 1 г |
| KH2PO4 | 1 г |
| MgSO4.7H2O | 0,2 г |
| CaCl2.6H2O | 0,2 г |
| FeCl2 | 2 капли концентрированного раствора |
| pH=7,2 |
На склянках надписывают номер станции, объем посеянной воды и дату. Затем производят посев обычно от 0,1 мл до 0,0000001 мл (т. е. 10-7). Склянки ставят в термостат при 30оС и наблюдают за изменениями среды на 3-, 7- и 14-й день. Отмечают помутнение, образование пленки, осадка, окрашивание среды.
В качестве конечного результата записывают максимальный титр бактерий, при котором наблюдаются изменения среды. Например, если при посеве от 0,1 до 0,0000001 мл развитие бактерий отмечено до разведении 0,00001 мл, то в качестве конечного результата записывают титр 10 , что соответствует примерному содержанию нефтеокисляющих бактерий — 100000 клеток в 1 мл
Интенсивность разрушения нефтяных углеводородов определяется при инкубации проб воды при 20оС с добавлением в склянки стерильного нефтепродукта. Для этого разливают с необходимыми при определении кислорода предосторожностями исследуемую воду в четыре кислородные склянки вместимостью по 150 мл. В две из них добавляют 0,05 мл солярового масла Все склянки закрывают пробками и помещают в темноту при 20оС (обычно используют эмалированное ведро с крышкой). Через 3 дня в склянках фиксируют кислород добавлением MnCl2 и КL + NаОН, затем определяют в каждой из них содержание кислорода. По разности между его содержанием в склянках без нефтепродукта и с нефтепродуктом судят о потенциальной окислительной способности (ПОС) микрофлоры воды и разрушению нефтяных углеводородов.
б) Фенолокисляющие бактерии
Посев производят на среду Егоровой, заранее разлитую в пенициллиновые склянки. Объем высеваемой воды — от 1 до 0,0001 мл. Просмотр посевов такой же, как при учете нефтеокисляющих микроорганизмов.| Вода дистиллированная | 1 л |
| K2HPO4 | 1 г |
| MgSO4 | 0,2 г |
| NaCl | 0,2 г |
| CaCl2 | 0,1 г |
| FeCl3 | 0,02 г |
| (NH4)2SO4 | 0,1 г |
| MnSO4 | 0,01 г |
| (NH4)2HPO3 | 0,5 г |
| Фенол | 1 г |
в) Сульфатредуцирующие бактерии
Посев производит из придонной воды или ила на твердую среду Кравцова-Сорокина.| K2HPO4 | 0,5 г |
| NaH2PO4 | 0,3 г |
| Na2SO4 | 0,5 г |
| MgSO4.7H2O | 0,1 г |
| (NH4)2SO4 | 0,2 г |
| Соль Мора (NH4)2Fe(SO4)2.6N2O* | 1 г |
| Молочнокислый кальций | 2 г |
| Водопроводная вода | 50 мл |
В стерильные пробирки в зависимости от ожидаемого количества бактерий разливают от 1 до 0,001 мл исследуемой воды, заливают подготовленной средой, закрывают стерильными резиновыми пробками и ставят в стакан с холодной водой. После затвердевания помешают в термостат при 30оС и через 3-4 недели считают выросшие темные колонии. Пересчет производят на 1 мл.
Определение времени удвоения численности бактерий и продукции бактериальной биомассы
Отобранную в стерильную посуду исследуемую воду фильтруют (для удаления фито- и зоопланктона) через предварительный мембранный фильтр №6 в стерильную склянку или колбу. Фильтровальную воронку предварительно необходимо протереть спиртом и обжечь. Для фильтрации применяют свежекипяченые фильтры. Фильтры кипятят несколько раз в дистиллированной воде, меняя воду. Перед началом кипячения их погружают в горячую волу. Из профильтрованной воды с соблюдением правил стерильности делают посев на МПА и фильтруют требуемое количество на мембранном фильтре по методу прямого счета. Склянку с профильтрованной водой выдерживают некоторое время при температуре и освещении, близких и естественным, после чего анализ численности бактерий повторяют. Время выдерживания склянок должно быть достаточным для достоверного улавливания разницы между исходной и конечной численностью бактерий в пробе. Летом рекомендуется следующее время: для эвтрофных водоемов 1-6 часов; для мезотрофных — 6-18 часов; для олиготрофных — 24-48 часов. При низких температурах весной и осенью время выдерживания проб увеличивается в несколько раз.Расчет времени удвоения (g) численности бактерий (общего количества — go и числа сапрофитных — gc) производят по формуле:
, Для определения продукции бактерий нефильтрованную воду из той же пробы воды выдерживают в течение времени t в идентичных условиях и затем определяют исходное (B1) и конечное (b1) количество бактерий в естественной нефильтрованной воде методом прямого счета. Расчет часовой продукции бактериальной массы производят по формуле: