Мониторинг перифитона

Выбор места и времени отбора проб

Если исходить из постулата непрерывности водных экосистем как целостных природных образований, являющихся в свою очередь составными частями более крупных природно-ландшафтных комплексов, то за элементарную единицу экологического исследования следует признать как минимум водосборный бассейн. С методологических позиций принципиально важно показать генетический ряд водных экосистем от зон формировании стока до зон его рассеивания и проследить в этом ряду пространственные сукцессии биоценозов перифитона на фоне различных условий существовании При этом весьма ценным свойством перифитонных сообществ является их приуроченность к субстратам, к определенным локализованным участкам, что позволяет с большой надежностью проводить пространственную экологическую бонитировку (биологическое зонирование) водосборов по показателям перифитона. 

Под биологическим зонированием подразумевается выделение в водосборном бассейне, как в экосистеме более высокого порядка, дискретных участков в виде контрастных водных масс и переходных зон, различающихся составом и структурой перифитонных сообществ и качеством воды, рассчитанным с помощью формальных индексов по показателям перифитона. Такой подход позволяет выявить характерные биоценозы перифитона, которые соответствуют определенному экологическому состоянию водных объектов. Имея достаточно разнообразную информацию об экологических ситуациях в конкретном регионе, можно методом экстраполяции предвидеть и спрогнозировать возникновение похожих ситуаций в любой точке водосборного бассейна, где предполагаются те или иные изменения антропогенной нагрузки на ландшафт. 

Наиболее целесообразно проводить биологическое зонирование в летний или переходный летне-осенний сезон, являющийся для большинства регионов биологическим летом, т. е. периодом максимальной активизации гидробиологических процессов. В этот отрезок времени очень контрастно проявляются типовые и индивидуальные биоценотические различия между водными экосистемами, связанные в первую очередь с разницей температур водных массв различных участках водосборного бассейна. В холодные же сезоны года температурный градиент выравнивается и биоценотические различия между контрастными участками водосборов сглаживаются. 

Биологическое зонирование является необходимым начальным этапом для более универсальных обобщений, имеющих конечной целью разработку региональной экологической классификации. Классификация может быть использована не только для обобщения информации о состоянии водных экосистем, но и для оценки подверженности экосистем деградации, а следовательно, и для нормирования антропогенного воздействия. Кроме того, на основании экологической классификации становится возможным проследить основные направления в изменении биоценозов перифитона под влиянием комплекса абиотических факторов, организовать контроль за экологическим состоянием водных объектов как элементов ландшафта по показателям перифитона и в конечном счете прогнозировать динамику изменений экологического статуса различных участков водосбора в сезонном и многолетнем аспектах. 

Чтобы судить о динамике изменения биоценозов перифитона в течение года, наблюдениями следует охватить все биологические сезоны Чем чаще проводятся наблюдения (особенно на начальном этапе исследований), тем более полноценной биологической информацией располагает гидробиолог и тем легче организовать последующие наблюдения по биологически эквивалентной шкале с учетом последовательности и продолжительности биологических фаз, составляющих годовой цикл развития биоценозов перифитона. 

Створы для сбора проб перифитона должны по возможности совпадать со створами, намеченными для общепринятого гидробиологического и гидрохимического обследования и охватывать различные по уровню загрязнения и общей антропогенной нагрузке участки водосборных бассейнов (приуроченные к разным типам ландшафта фоновые участки, загрязненные участки, зоны самоочищения, устьевые участки, зарегулированные и незарегулированные водотоки и др.). Сеть пунктов и створов отбора проб перифитона, таким образом, должна характеризовать, с одной стороны, картину современного гидробиологического состоянии основных водосборных бассейнов изучаемого региона, а с другой — служить достаточно обширным источником формирования базы данных для экологических прогнозов. 

Наибольшее показательное значение имеет перифитон, развивающийся на субстратах в проточных и открытых местах водных объектов, где невозможны какие-либо случайные застои грязной или чистой воды. В реках, например, идеальным местом отбора перифитона являются каменистые перекаты. В то же время при проведении специальных исследований, связанных, например, с картированием отдельных участков водных объектов, могут изучаться перифитонные сообщества из разных “микрозон”, что определяется целью конкретного исследования. 

Методика отбора проб перифитона с естественных субстратов

Необходимо также дать визуальную оценку качества воды (ее цвет, мутность, характер взвеси), отметить признаки загрязнения поверхности и толщи водной массы в пункте отбора проб Все эти данные заносятся в полевой журнал, где указывают дату обследования, название водного объекта, местонахождение и номер створа, температуру воды и время отбора пробы (что важно при интерпретации характеристики температурного режима водной массы), скорость течения, температуру воздуха. Важное значение имеют сведения о погодных условиях и природных явлениях во время отбора проб и в предшествующие дни, которые могли повлиять на гидрологическую обстановку, вызвать изменения гидрохимических и гидробиологических показателей, затруднить отбор проб обрастаний или их визуальное описание. К таким явлениям прежде всего следует отнести дождевые ливни, паводки, сели, резкие изменения уровня воды в реках, ветры и волнение в водоемах, штилевая солнечная погода, вызывающая интенсивный прогрев водной массы и др. 

При визуальном описании перифитона удобно пользоваться стандартными для обследуемого водосбора терминами, перечень которых должен включать тип обрастаний (налет, пленка, слой, корка, нарост, бахрома, пряди, космы нитчатых водорослей и т д.), их характер (слизистые, рыхлые, плотные, кожистые, известковой структуры, губкообразные, ватообразные, нежные, грубые, слабые, тонкие, толстые и т. д), цвет обростов, геометрию распределения (гетерогенное мозаичное, равномерное однообразное, в прибрежье, на глубине, в проточных и застойных зонах и т. д.). 

Необходимо также оценить проективное покрытие каждого типа обрастаний в процентах от общей площади субстратов, как это рекомендовано в руководстве СЭВ. Для этого на определенной, хорошо просматриваемой акватории водного объекта (обычно это 1-10 м²) осматриваются и отмечаются типы обростов на характерных субстратах и по глазомерной шкале оценивается их распространенность в баллах в зависимости от занимаемой площади: 

Распространенность, баллы	1	3	3	5	7	9
Занимаемая площадь, %	<1	1-3	3-10	10-20	20-40	40-100

Эти сведения заносятся в полевой журнал и в дальнейшем используются для оценки динамики изменений биоценозов перифитона и общего заключения об экологическом состоянии водного объекта. 

Наиболее пригодными для сбора перифитона являются нейтральные субстраты (камни, бетонные сооружения); они дают хорошо сравнимые результаты. Не следует отбирать пробы с поверхности деревянных предметов, так как разлагающаяся древесина вызывает микросукцессии в развивающихся на таких субстратах обрастаниях и может исказить представление о действительном состоянии биоценозов. Сбор оброста с макрофитов осуществляют лишь в тех случаях, когда на створе нет никаких других субстратов; это обусловлено тем, что макрофиты оказывают заметное влияние на состав и количественное развитие перифитона. Рекомендуется отбирать пробы хотя бы на одинаковых видах макрофитов сравниваемых створов. Для получения сопоставимых результатов отбор проб на разных створах желательно производить с одних и тех же субстратов. 

С поверхности листьев и стеблей макрофитов сбор перифитона производят, смывая оброст мягкой кисточкой. Такие растении, как роголистник, уруть, с узкими листовыми пластинками, помещают в склянку с водой и тщательно полощут. Затем растение вынимают, а смытый оброст сохраняют для анализа. 

Отбор обростов с поверхности твердых предметов производят с помощью скребка, ножа, скальпеля, пинцета или обычной столовой ложки с заточенным краем. В случае слабого развития перифитона, когда оброст представлен едва осязаемым на ощупь слизистым налетом, следует использовать зубную щетку, которую нужно тщательно ополаскивать в склянке с небольшим количеством воды. 

Небольшое количество материала помещают в широкогорлую банку с водой и с большим запасом воздуха. Приблизительное количество каждого тина оброста в интегральной пробе должно быть пропорционально его распространенности в створе наблюдений, оцененной по глазомерной шкале. В зависимости от цели исследования каждый тип оброста может отбираться и анализироваться самостоятельно 

Пробы обрастаний необходимо обрабатывать непосредственно после отбора или в срок, гарантирующий сохранность живого материала (приблизительно в течение 6 часов после отбора проб, сохраняемых при температуре 5-10^оС). 

Методика отбора проб перифитона с искусственных субстратов

В качестве искусственных субстратов рекомендуется использовать предметные стекла. Погружение стекол в воду производится с помощью различных установок. Удобно использовать для этих целей пенопластовые поплавки, резиновые пробки, в прорези которых вставляют одним концом “стекла обрастаний”. Поплавки и пробки со стеклами надевают на заякоренный трос или вбитый в грунт длинный штырь, шест, трубку и т. д. Глубина погружении определяется в зависимости от прозрачности воды. Нижняя граница распространения перифитона совпадает со значением прозрачности 1-1,5 балла. 

Длительность экспозиции стекол определяется географическим положением, качеством воды изучаемого водного объекта, сезоном года, целью исследования. 

При изучении биоценотических связей исследования начинают с первых же суток погружения стекол, прослеживая все стадии процесса сукцессии. 

Извлекать стекло из установки следует очень осторожно, не вынимая всю установку из воды. Стекло помещают в широкогорлую склянку с измеренным количеством воды. 

В лаборатории стекло помещают в чашку Петри так, чтобы оно было покрыто водой, и просматривают под бинокуляром. Крупные организмы просчитывают во всей пробе. Если оброст не очень густой, непосредственно на стекле подсчитывают прикрепленные формы простейших и коловраток. Затем оброст тщательно смывают кисточкой в воду определенного объема. Подвижные мелкие организмы (простейшие, коловратки) считают в камере Богорова. Если в пробе очень много организмов, для подсчета берут не всю пробу. 

Для количественного учета водорослей взвесь смытого в воду определенного объема оброста тщательно перемешивают и берут из нее несколько мл для последующего подсчета. Подсчет производят в счетных камерах (Нажотта, Горяева). Рекомендуется применять поэтапную обработку проб в камерах разного объема для учета форм разного размера. 

Численность водорослей N подсчитывают по формуле 

, 

Биомассу водорослей определяют “объемным” методом. Для определения объема отдельной клетки ее форму приравнивают к близкому геометрическому телу (шару, цилиндру, эллипсоиду, сдвоенному конусу и др.) и находят его размеры. 

Для вычисления биомассы простейших производят измерения с помощью окуляр-микрометра или используют табличные данные. Объем клетки v определяют по формуле Симпсона 

_,

Найденный объем клетки (мкм³) умножают на число особей и получают значение биомассы. 

Численность выражают в единицах клетка/мм² (или млн. клеток/м²), биомассу в г/м² (или мг/м^2).

Обработка и этикетирование проб

В лаборатории отобранные пробы переносят из банок в чашки Петри и производят разборку материала. Крупные организмы (личинки насекомых, моллюски, олигохеты и т. д.) отбирают в отдельную склянку, фиксируют 4%-ным нейтральным формалином. 

Наибольшее внимание при изучении перифитона следует уделять анализу микроорганизмов и нитчатых колониальных водорослей, которые являются первичными поселенцами на субстратах и составляют основу биопленок. 

Для предварительного ознакомления с пробой и отлова подвижных микроорганизмов рекомендуется сначала просматривать ее под бинокуляром. Простейших и коловраток отлавливают с помощью микропипетки с оттянутым концом, помещают на предметное стекло в небольшую каплю воды и накрывают покровным стеклом с пластилиновыми ножками. Чтобы замедлить движение организмов, к препарату добавляют каплю клея из айвовых косточек. Клей готовят из нескольких косточек айвы, которые заливают небольшим количеством воды. Это делается за несколько часов до отбора и анализа проб. Приготовленный клей хранят в пенициллиновой склянке в холодильнике не более 2 сут и по мере необходимости готовят свежий. Челюстной аппарат коловраток рассматривают, растворяя их в жавелевой воде (10%-ном растворе едкого кали, насыщенном хлором) или в питьевой соде. Видовой состав простейших и коловраток идентифицируют, используя соответствующие определители. 

Изучение бактериального населения перифитона имеет огромное значение на створах, подверженных органическому загрязнению, где бактериальные организмы часто дают вспышку численности. Полное определение видового состава бактерий — технически сложная процедура. В оперативном гидробиологическом мониторинге бактериальное население перифитона можно изучать методом световой микроскопии одновременно с другими группами микроорганизмов. 

В препаратах живых проб перифитона при 400-900-кратном увеличении хорошо заметны морфологически различные формы бактерий (кокковидные, палочковидные, нитевидные, зооглейные, извитые, спиралевидные и др.), отдельные виды которых можно идентифицировать и учитывать при определении видового состава. 

Флористический состав перифитона можно определять в консервированной пробе, но желательно для первого ознакомления смотреть живую пробу, определяя сначале нежные и подвижные формы (жгутиковые, вольвоксовые, эвгленовые и т. п ). 

В качестве консерванта используют раствор Люголя в модификации Г. В. Кузьмина. Фиксатор готовят из двух растворов: 

Оба раствора сливают и хранят в темной склянке. В пробу добавляют 1-5 капель консерванта (в зависимости от густоты пробы), а через 2-3 часа доводят концентрацию до цвета темного чая. 

Можно применять в качестве консерванта и формалин. Сперва его добавляют по каплям (при одновременном осторожном перемешивании пробы) до появления слабого запаха формалина. Через 3-4 часа постепенно добавляют новую порцию формалина до появления его устойчивого запаха в пробе (до 3-4 в пробе). 

После предварительного просмотра пробы под бинокуляром, отлова и последующей идентификации подвижных простейших и коловраток, определяют под микроскопом нежные прикрепленные колониальные формы и массовые виды организмов в различных типах обрастаний, образцы которых могут до анализа храниться вместе или раздельно. Перечень типов обрастаний с оценкой их распространенности по глазомерной шкале и указанием массовых видов записываются в рабочий журнал. Эта информация может иметь самостоятельное значение в экспресс-оценке гидробиологического состояния водного объекта в створе наблюдений, при изучении сезонных сукцессий, а также использоваться при биологическом зонировании. 

Затем проводят интегральный анализ перифитона. Для этого делают интегральную пробу, добиваясь по возможности равномерного распределении в ней всех организмов. Если объем интегральной пробы (включая все тины обрастаний в створе) небольшой, то ее тщательно перемешивают при помощи двух препаровальных иголок или пинцетов с заостреными концами. 

При большом объеме общей пробы из нее выбирают образцы разных типов обрастаний, объемы которых пропорциональны их распространенности в створе наблюдений, и тщательно перемешивают на предметном стекле с лункой. Из приготовленной таким способом интегральной пробы делают препараты для микроскопирования. Препараты просматривают при разном увеличении до тех пор, пока не перестанут обнаруживаться новые виды. Обычно достаточно просмотреть 3-4 препарата. Одновременно с определением видового состава перифитона оценивают частоту встречаемости (показатель обилия) h для каждого вида по глазомерной шкале: 

9 — очень часто (в каждом поле зрения много),

7 — часто (в каждом поле зрения),

5 — нередко (не во всех полях зрения),

3 — редко (в немногих нолях зрения),

2 — очень редко (несколько экземпляров в препарате),

1 — единично (единичные экземпляры в пробе).

• организмы размером до 50 мкм оценивать при 400-600-кратном увеличении;
• организмы размером 50-200 мкм оценивать при 200-300-кратном увеличении;
• крупные организмы (больше 200 мкм) оценивать при 80-100-кратном увеличении.

Если суммировать показатель обилия h по отдельным таксонам (тип, семейство, род) или по функциональным группам (продуценты, консументы, редуценты), то получим численные выражения обилия , по которым можно судить об относительной роли различных групп организмов в биоценозе перифитона. 

Видовое определение диатомовых водорослей требует специальных методов обработки. Оно учитывает тонкую структуру панциря. Детали тонкой структуры, невидимые при обычных методах микроскопирования, различимы лишь при условии удаления протопласта и заключения пустых панцирей в среду с высоким показателем светового преломления. 

Методика удаления протопласта и приготовления постоянных препаратов диатомовых водорослей состоит в: 1) отмывке пробы от фиксатора и растворимых солей; 2) удалении нерастворимых в воде углекислых солей действием соляной кислоты; 3) сжигании протопласта в крепкой серной кислоте. 

Из небольшого количества пробы на предметном стекле с лункой удаляют с помощью препаровальной иглы частицы детрита, талломы нитчатых водорослей и крупные минеральные частицы. Эту процедуру проводят под бинокуляром или под лупой. Затем освобожденный от примесей материал помещают в центрифужную пробирку, наполовину заполненную дистиллированной водой, тщательно встряхивают, затем полностью заливают пробирку дистиллированной водой и центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин в течение 10 мин. Затем воду над осадком осторожно отсасывают. Отмывку повторяют 2-3 раза, в зависимости от количества материала и емкости центрифужной пробирки. 

Для удалении нерастворимых в воде углекислых солей осадок обрабатывают 10%-ной НСl (в центрифужной пробирке) при медленном нагревании до кипения. Затем остывшую пробу центрифугируют, осадок отмывают в дистиллированной воде повторным центрифугированием до полного удаления следов кислоты (проверки лакмусом). 

Для удаления протопласта рекомендуются технически наиболее простые методы холодного сжигания. 

Рекомендуется отмытый от фиксатора и нерастворимых солей материал выдерживать в концентрированной серной кислоте не менее 0,5-1,0 сут; затем прибавляют мелкие кристаллики двухромовокислого калия (К₂Сг₂О₇), который окисляет обугленное органическое вещество и обесцвечивает осадок 

Также рекомендуется готовить свежую хромовую смесь. Для этого 20 г К₂Сr₂О₇ растворяют в 300 мл концентрированной серной кислоты (если К₂Сг₂О₇ не растворяется, раствор подогревают до кипения); хромовой смесью заливают осадок, находящийся в центрифужной пробирке (1 см³ осадка и 2 см³ хромовой смеси); через 1 час раствор центрифугируют в течение 10 мин и отсасывают раствор над осадком. 

Обработанный одним из предложенных способов осадок затем отмывают дистиллированной водой с центрифугированием до удаления следов кислоты (проверка лакмусом). Небольшое количество перемешанного осадка наносят на покровное стекло, равномерно распределяют по всей поверхности с помощью препаровальной иглы и подсушивают на электроплитке, одновременно подогревая предметное стекло. На подогретое предметное стекло кладут кусочек смолы. Когда она расплавится, на нее кладут теплое покровное стекло осадком вниз. Слегка надавливая на покровное стекло, добиваются равномерного распределения смолы. Следует избегать закипания смолы, так как образующиеся пузырьки воздуха могут испортить препарат. Препарат надо быстро охладить, положив его на холодную поверхность (металлическую, стеклянную), так как при медленном охлаждении образуются кристаллы, мешающие микроскопированию. 

Для приготовления постоянных диатомовых препаратов рекомендуется применять различные твердые среды с высокими показателями светового преломления: среду Кольбе-Вислоуха с показателем преломления 1,63-1,65, кумароновую смолу с показателем преломления 1,72, смесь селена и серы (3 части серы и 4 части селена по массе) с показателем преломления 2,12, анилин-формальдегидной смолу А. А. Эльяшева с показателем преломления 1,67-1,68. Кроме того, существуют готовые смолы: гиракс — синтетическая смола (АFS), состоящая из анилина, формальдегида и серы (показатель преломления 1,8); плевракс — синтетическая смола (показатель преломления 1,9); стиракс — естественная смола (показатель преломления 1,58); канадский бальзам — естественная смола (показатель преломления 1,53). Стиракс и канадский бальзам употребляются в основном для анализа грубоструктурных форм. 

Для исследования препаратов необходимо использовать тонкие покровные стекла (не толще 0,18 мм), ввиду того что иммерсионный объектив имеет очень короткое фокусное расстояние.